Please use this identifier to cite or link to this item:
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorวสุ ปฐมอารีย์-
dc.contributor.advisorสายสมร ลำยอง-
dc.contributor.advisorสกุณณี บวรสมบัติ-
dc.contributor.advisorรัตนาภรณ์ ศรีวิบูลย์-
dc.contributor.authorPornpan Ruttanasutjaen_US
dc.contributor.authorพรพรรณ รัตนะสัจจะen_US
dc.description.abstractFour sediment samples from Rayong Province, Thailand were examined for actinomycete diversity by culture independent method. DNA library was constructed using actinomycete specific primers. A total of 153 non chrimeric clones were analyzed. All clones were affiliated in the Class Actinobacteria covering 4 subclasses, 4 orders, 9 suborders, 23 families and 39 genera. Dominant actinomycete groups in all 4 samples were members of the genus Illumatobacter in the family Acidimicrobiaceae and genus Iamia in the family Iamiaceae. The highest actinomycete diversity in term of species richness and distribution was found in the sediment from Klong–Ta–Guan with Chao's value of 343 ribotypes at species level, Shanon Wiener and Simpson index of 3.76 and 0.26, respectively. Ninety clone sequences (58%) showed less than 97% 16S rRNA similarity to any known actinomycete culture and may represent novel species. These findings suggest that the diversity of actinomycetes in Thai coastal sediments is high and large numbers of actinomycetes remains to be characterized by cultivation for bioprospecting. An improved isolation method for actinomycetes from coastal marine sediments was developed. Four pretreatments, 3 enrichment broths and 15 selective media were tested for isolation using sediment sample from Klong–Ta–Guan. Pretreatment methods were (1) preparation of soil suspension by tenfold dilution and shaking 10-1 dilution of sediment suspension at 125 rpm for 10 minutes (2) 1.5% phenol treatment (3) shaking sediment suspension (1 g: 3 ml) at 125 rpm for 10 minutes and (4) shaking sediment suspension (1 g: 3 ml) at 125 rpm for 60 minutes. Three enrichment broths were (1) Marine Broth (MB) (2) Soil Extract Solution (SES) and (3) Marine Soil Extract Broth (MSB). All isolation plates from 15 selective media were incubated at 25oC for 30 days. Actinomycetes were isolated only from pretreatment (4). Marine broth was found to promote the isolation of actinomycetes with high ratio of total bacteria : actinomycetes (2:1). In general, diluted media or low nutrient media were more effective in the isolation of actinomycetes. A total of 209 isolates of actinomycetes were obtained with colony count ranging from 0–747 cfu/g. Molecular identification based on 16S rRNA gene sequencing revealed that these isolates belonged to 8 genera, namely Curtobacterium, Dermacoccus, Micromonospora, Microbispora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Streptomyces and Tsukamurella. However, results from culture dependent and culture independent studies of Klong-Ta-Guan sediment, showed only 3 overlap genera, namely Micromonospora, Rhodococcus and Streptomyces. This isolation method was then used to isolate actinomycetes from other 7 sediment samples. In total, 529 isolates were obtained from all sediment samples and were identified to members of 3 genera: Micromonospora, Rhodococcus and Streptomyces. These results showed the highest diversity in Klong–Ta–Guan sample which were in agreement with the results from culture independent study. The study on 7 basal media for Chrome azurol S (CAS) assay which used for prescreening of siderophore production, indicated that Modified King B Agar (MKBA) (pH 7.0) was the most suitable media for actinomycete growth and siderophore production. A total of 738 isolates were screened for siderophore production by CASMKBA (pH 7.0) based medium and all of them produced siderophore. Seventy–nine isolates of Pseudonocardia and Streptomyces which showed large orange halo zone were selected for determination of type and quantity of produced siderophore by ferric perchlorate assay for hydroxamate type and Arnow’s assay for catecholate type. All actinomycete isolates produced hydroxamates type siderophore with more than half (69.62%) produced both hydroxamate and catecholate types. Streptomyces sp R1-2A/J806 from Klong–Ta–Guan sample showed the highest yield of 2.03 nmol/l and 0.81 mmol/l for hydroxamate and catecholate types, respectively. The type of siderophore was confirmed by thin layer chromatography which showed similar results with screening in both agar plate and culture broth. Time course study of siderophore production from actinomycetes was carried out using isolates R1–2B/D805 and R1–2B/N205, the highest hydroxamate and catecholate producer, respectively. Actinomycetes were cultured in MKB broth (pH 7.0) and growth and siderophore production were measured. It was found that actinomycetes produced highest siderophore during late log phase or early stationary phase. Each type of siderophore was produced in different growth period. Siderophore producing genes were detected using desD gene for hydroxamate type and entF gene for catecholate type. All of 79 isolates were detected with desD gene which encode desferrioxamine. Comparison of sequence data showed that these desD genes were closely related to desD genes in various Streptomyces sp. Furthermore, the entF gene which encodes for enterobactin was not found in all the 55 catecholate producing isolates. This observation suggested that these isolates may contain catecholate type genes other than enterobactin. All siderophore producing actinomyctes were tested for their antibacterial activity against three bacterial pathogens; Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens and Vibrio parahaemolyticus by agar well diffusion method on MKBA (pH 7.0), which supported siderophore production and Modified King B Iron Agar (MKBIA) (pH 7.0), which inhibited siderophore production. The antifungal activity was tested with two fungal pathogens; Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum by dual culture method on CAS–MKBA (pH 7.0) and CAS–MKBIA (pH 7.0). A total of 24 isolates (3.25%) showed antibacterial activity against at least one tested pathogenic bacterium and only 7 isolates (0.95%) inhibited all pathogenic bacteria. Seventy-nine isolates (10.70%) showed growth inhibitory activity against all pathogenic fungi, isolate R8-K310 from Had-Sai-Thong sediment showed the highest inhibition of 59% and 61% for C. gloeosporioides and 57% and 53% for F. oxysporum on CAS–MKBA (pH 7.0) and CAS–MKBIA (pH 7.0), respectively. Both antibacterial and antifungal activities of actinomycetes on MKBA (pH 7.0) and MKBIA (pH 7.0), did not show any statistically difference (P<0.05). This result suggested that the antagonistic activity was not related to siderophore production but may be due to the inhibitory effect of other secondary metabolites. Keywords: marine actinomycetes, marine sediment, metagenomic clone library, pretreatment method, enrichment method, selective media, siderophore, antimicrobial agenten_US
dc.publisherเชียงใหม่ : บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเชียงใหม่en_US
dc.subjectCoastal marine sedimentsen_US
dc.titleDiversity and Siderophore Production of Actinomycetes from Eastern Thai Coastal Marine Sedimentsen_US
thailis.controlvocab.thashActinomycetes -- Microbiology-
thailis.controlvocab.thashBioactive compounds -- Thai-
thailis.controlvocab.thashCoasts -- Thai-
thailis.controlvocab.thashSoils -- Analysis-
thailis.manuscript.callnumberTh 579.37 P836D-
thesis.description.thaiAbstractตัวอย่างดินตะกอนชายฝั่งทะเลทางตะวันออกของประเทศไทยจำนวน 4 ตัวอย่าง ถูกนำมาศึกษาความหลากหลายของแอคติโนมัยซีทจากทะเล โดยใช้วิธีการทางด้านอณูชีววิทยาด้วยเทคนิคไม่เพาะเลี้ยงเชื้อ เมื่อทำการสร้างห้องสมุดดีเอ็นเอใช้ไพร์เมอร์ที่จำเพาะเจาะจงได้จำนวนโคลนทั้งหมด 153 โคลนเมื่อนำมาวิเคราะห์ผล พบว่ามีความสัมพันธ์เป็นสมาชิกของ class Actinobacteria ประกอบด้วย 4 subclasses, 4 orders, 9 suborders, 23 families และ 39 genera ซึ่งกลุ่มของแอคติโนมัยซีทเด่นที่สามารถพบทั้ง 4 ตัวอย่าง คือ จีนัส Illumatobacterในแฟมิลี่ Acidimicrobiaceae และจีนัส Iamiaในแฟมิลี่ Iamiaceaeความหลากหลายของแอคติโนมัยซีทสูงที่สุดทั้งในด้านจำนวนและการกระจายตัวของสปีชีส์ในตัวอย่างดินที่ 1 จากคลองตากวนโดยผลการวิเคราะห์ค่า Chao ที่มากถึง 343 ไรโบไทป์ในระดับของสปีชีส์ และค่าการกระจายตัวจาก Shanon Wiener และ Simpson index ที่มีค่า 3.67 และ 0.26 ตามลำดับทั้งนี้มีจำนวนโคลนมากถึง 90โคลน (58%) ที่มีเปอร์เซ็นต์ความคล้ายกันของยีน 16S rRNA กับแอคติโนมัยซีทที่เพาะเลี้ยงได้ต่ำกว่า 97% และมีความเป็นไปได้ว่าอาจจะเป็นสปีชีส์ใหม่จากการศึกษาดังกล่าวชี้ให้เห็นว่าดินตะกอนชายฝั่งทะเลมีความหลากหลายของแอคติโนมัยซีทสูงและมีจำนวนแอคติโนมัยซีทอยู่เป็นปริมาณมากที่รอการศึกษาโดยการเพาะเลี้ยงเพื่อนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป ทำการปรับปรุงวิธีการแยกแอคติโนมัยซีทจากดินตะกอนชายฝั่งทะเล โดยใช้วีธีการ Pretreatment 4 แบบ อาหารเหลวสำหรับการ enrichment จำนวน3ชนิด และอาหารแข็งสำหรับการแยกเชื้อจำนวน 15 ชนิด ถูกนำไปทดสอบการแยกเชื้อแอคติโนมัยซีทในดินตัวอย่างจากคลองตากวน ซึ่ง Pretreatment ที่ใช้คือ (1) เขย่าสารละลายตะกอนดินที่เตรียมแบบเจือจางลำดับส่วนที่ความเข้มข้น 10-1 ที่ความเร็ว 125 รอบ/นาที นาน 60 นาที (2) 1.5% phenol treatment (3) การเขย่าสารละลายตะกอนดิน (1 กรัม: 3 มิลลิตร) ที่ความเร็ว 125 รอบ/นาที นาน 10 นาที และ (4) การเขย่าสารละลายตะกอนดิน (1 กรัม: 3 มิลลิตร) ที่ความเร็ว 125 รอบ/นาที นาน 60 นาที ร่วมกับการใช้อาหารเหลวเลี้ยงเชื้อในการ Enrichment ทั้ง 3 ชนิด คือ (1) Marine broth (MB) (2) Soil extract solution (SES) และ (3) Marine soil extract broth (MSB) จากนั้นนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็งเลี้ยงเชื้อจำนวน 15 ชนิด บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลา 30 วัน พบการเจริญของแอคติโนมัยซีทเฉพาะตะกอนดินที่ผ่านการ Pretreatment แบบที่ (4) เท่านั้นและตะกอนดินที่ผ่านการ Enrichment ด้วยอาหาร MB พบการเจริญของแอคติโนมัยซีทที่มีค่าอัตราส่วนของจำนวนแอคติโนมัยซีทต่อแบคทีเรียสูงที่สุด คือ 2:1 ทั้งนี้ยังพบว่าอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีการเจือจางหรือมีปริมาณสารอาหารน้อยมีประสิทธิภาพสูงต่อการแยกแอคติโนมัยซีท ซึ่งได้แอคติโนมัยซีททั้งหมด 209 ไอโซเลท จากจำนวนโคโลนีทั้งหมดที่นับได้ในช่วง 0-74 cfu/g จากการบ่งชี้ชนิดด้วยการหาลำดับยีนส่วน 16S rRNA สามารถจำแนกแอคติโนมัยซีทได้หลายจีนัส เช่น Curtobacterium, Dermacoccus, Microbispora, Micromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, StreptomycesและTsukamurellaแต่เมื่อเปรียบเทียบข้อมูลที่ได้จากการศึกษาทางด้านอณูชีววิทยาด้วยเทคนิคไม่เพาะเลี้ยงเชื้อของดินตัวอย่างจากคลองตากวน พบว่าสามารถแยกเชื้อแอคติโนมัยซีทได้เพียง 3 จีนัส คือ Micromonospora, Rhodococcus and Streptomycesเมื่อเทียบกับโคลนในห้องสมุดดีเอ็นเอซึ่งพบแอคติโนมัยซีททั้งสิ้น 7 จีนัสซึ่งวิธีการแยกเชื้อดังกล่าวถูกนำไปใช้ในการแยกแอคติโนมัยซีทในตัวอย่างดินตะกอนทะเลอื่น ๆ อีก 7 ตัวอย่าง ได้จำนวนไอโซเลทรวมทั้งหมด 529 ไอโซเลทเมื่อนำไปทำการจัดจำแนกพบว่าแอคติโนมัยซีทที่แยกจากทั้ง 7 ตัวอย่าง เป็นสมาชิกของจีนัสMicromonospora, RhodococcusและStreptomycesผลของการจัดจำแนกดังกล่าวพบว่าตัวอย่างดิน R1 จากคลองตากวนมีความหลากหลายของแอคติโนมัยซีทสูงที่สุด ซึ่งให้ผลสอดคล้องกับการศึกษาด้วยวิธีการทางด้านอณูชีววิทยาด้วยเทคนิคไม่เพาะเลี้ยงเชื้อ การศึกษาชนิดของอาหารพื้นฐานจำนวน 7 ชนิด ที่ใช้ในวิธีการทดสอบการสร้างสาร ไซเดอโรฟอร์เบื้องต้นด้วยวิธีการเฉพาะ Chrome azurol S (CAS) พบว่าอาหารพื้นฐาน Modified King B Agar(MKBA) (pH 7.0) เหมาะสมที่สุดต่อการเจริญและสร้างสารไซเดอร์โรฟอร์จากแอคติโนมัยซีทเมื่อนำเชื้อแอคติโนมัยซีททั้งหมดจำนวน 738 ไอโซเลทมาทำการทดสอบความสามารถในการสร้างสารไซเดอร์โรฟอร์ด้วยการใช้อาหารแข็งทดสอบ CASMKBA (pH 7.0) พบว่าแอคติโนมัยซีททุกไอโซเลทสามารถสร้างสารไซเดอร์โรฟอร์ได้โดยแอคติโนมัยซีทในกลุ่ม PseudonocardiaและStreptomycesจำนวน 79ไอโซเลทที่แยกได้จากดินตะกอนทั้ง 8 ตัวอย่างมีการสร้างวงสีส้มขนาดกว้างมากและถูกเลือกมาทดสอบหาชนิดและปริมาณของไซเดอร์โรฟอร์ด้วยวิธีการของ Arnow สำหรับไซเดอโรฟอร์ชนิด Hydroxamateและวิธี Csaky สำหรับไซเดอโรฟอร์ชนิด Catecholateพบว่าทั้ง 79 ไอโซเลทสร้างไซเดอร์โรฟอร์ชนิด Hydroxamate และไอโซเลทมากกว่าครึ่ง (69.62%) สร้างทั้ง Hydroxamate และ Catecholate โดยมี Streptomyces sp.ไอโซเลทR1-2A/J806 ที่แยกได้จากตัวอย่างดิน R1 คลองตากวนมีการสร้างสารไซเดอร์โรฟอร์ทั้งสองชนิดในปริมาณที่สูง คือ 2.03 mmol/lและ0.81 mmol/lสำหรับไซเดอร์โรฟอร์ชนิด Hydroxamate และ Catecholate ตามลำดับ ทั้งนี้ทำการยืนยันชนิดของไซเดอร์โรฟอร์ที่วัดได้ด้วยวิธี Thin layer chromatography จากสารสกัดไซเดอร์โรฟอร์จากส่วนใสของน้ำเลี้ยงเชื้อตัวอย่าง โดยผลที่ได้ยืนยันชนิดของไซเดอโรฟอร์เช่นเดียวกับการตรวจสอบบนอาหารแข็งและในอาหารเหลว จากนั้นทำการตรวจสอบยีนที่มีผลต่อการสร้างไซเดอโรฟอร์แต่ละชนิด โดยศึกษายีน desDสำหรับการสร้างไซเดอโรฟอร์ชนิด Hydroxamate และศึกษายีน entFสำหรับการสร้างไซเดอโรฟอร์ชนิด Catecholate พบว่า ทั้ง 79 ไอโซเลทมียีนสำหรับการสร้างไซเดอโรฟอร์ชนิด Hydroxamateในกลุ่ม desferrioxamine และเมื่อเปรียบเทียบข้อมูลทางอณูชีววิทยาพบว่ามีความสัมพันธ์ใกล้เคียงกับยีน desDที่มีรายงานว่ามีอยู่ใน Streptomyces sp. หลายชนิด ทั้งนี้จากการศึกษาแอคติโนมัยซีทจำนวน 55 ไอโซเลทที่พบมีการสร้างไซเดอโรฟอร์ชนิดCatecholateไม่พบยีน entF ซึ่งควบคุมการสร้างไซเดอโรฟอร์ชนิด Catecholate ในกลุ่มenterobactin ซึ่งเป็นไปได้ว่าอาจมีการสร้างสารไซเดอโรฟอร์ชนิด Catecholate กลุ่มอื่นเมื่อนำแอคติโนมัยซีททั้งหมดที่มีการสร้างไซเดอร์โรฟอร์มาทดสอบความสามารถในการสร้างสารต้านจุลชีพต้านการเจริญของแบคทีเรียก่อโรค 3 ชนิดคือ Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescensและ Vibrio parahaemolyticusด้วยวิธีการ agar well diffusion และเชื้อราก่อโรค 2 ชนิด คือ Colletotrichum gloeosporioidesและFusarium oxysporumด้วยวิธีการ dual culture บนอาหาร 2 ชนิด ซึ่งส่งเสริมการสร้างและยับยั้งการสร้างไซเดอร์โรฟอร์ คือ MKBA (pH 7.0) และ Modified King B Iron Agar (MKBIA) (pH 7.0) ตามลำดับ พบว่าเชื้อแอคติโนมัยซีทจำนวน 24ไอโซเลท (3.25%) ที่มีความสามารถในการสร้างสารยับยั้งแบคทีเรียอย่างน้อย 1 ชนิด และมีเพียง 7ไอโซเลท (0.95%) ที่สร้างสารยับยั้งแบคทีเรียก่อโรคทั้ง 3 ชนิดได้ โดยไอโซเลททั้งหมดสามารถสร้างสารยับยั้งราก่อโรค ซึ่งไอโซเลทที่มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเชื้อราสูงสุดคือ R8-K310 จากตัวอย่างดินหาดทรายทอง (R8) คือ 59% และ 61% ต่อการยับยั้งC. gloeosporioidesและ 57% และ 53% ต่อการยับยั้ง F. oxysporumในอาหาร MKBA(pH 7.0)และ MKBIA (pH 7.0) ตามลำดับ โดยผลการสร้างสารต้านจุลชีพก่อโรคไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญบนอาหารทั้งสองชนิด ชี้ให้เห็นว่า การสร้างไซเดอร์โรฟอร์ของแอคติโนมัยซีทไม่มีผลในการยับยั้งการเจริญของจุลชีพก่อโรค คำสำคัญ:แอคติโนมัยซีทจากทะเล, ดินตะกอนทะเล, เมทตาจิโนมิกซ์ โคลนไลบรารี่, วิธีการ pretreatment, วิธีการ enrichment, อาหารเลี้ยงเชื้อ, ไซเดอร์โรฟอร์, สารต้านจุลชีพen_US
Appears in Collections:SCIENCE: Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
ABSTRACT.pdfABSTRACT334.66 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
APPENDIX.pdfAPPENDIX513.14 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 1.pdfCHAPTER 1213.25 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 2.pdfCHAPTER 22.23 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 3.pdfCHAPTER 31.45 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 4.pdfCHAPTER 4867.71 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 5.pdfCHAPTER 51.65 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 6.pdfCHAPTER 61.35 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CHAPTER 7.pdfCHAPTER 7152.05 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
CONTENT.pdfCONTENT292.37 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy
COVER.pdfCOVER1.07 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy
REFERENCE.pdfREFERENCE342.53 kBAdobe PDFView/Open    Request a copy

Items in CMUIR are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.